金属-β-内酰胺酶催化中间体的环丁酮模拟物

摘要：

相关研究已经证实，细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的机制主要涉及两类β-内酰胺酶（分别为亲核性丝氨酸（SBL）和金属-β-内酰胺酶（MBL））对药物的水解过程。环丁酮是一种水解稳定型β-内酰胺类似物，该等类似物对SBL和MBL均具有潜在抑制作用。本项工作主要针对环丁酮青霉烯类似物与临床上重要的MBL SPM-1之间的相互作用进行了溶液和结晶学层面的研究。通过使用19F标记的SPM-1进行NMR测试可以看出，环丁酮与SPM-1之间存在微摩尔水平的亲和力。从SPM-1:环丁酮复合物的晶体结构可以看出，水合环丁酮能够通过与其中一个锌离子相互作用而“成键”，并且该该水合物能够通过与“锌结合水”形成氢键获得稳定，以及疏水基团与芳香族残基之间存在接触。除此之外，从上述信息中还可以看出，未来有必要进行有关使用过渡态和（或）中间体类似物作为所有类型的β-内酰胺酶抑制剂的研究。

耐药性

作为目前一类最为常见的抗生素，β-内酰胺类药物（如图1所示）的应用已有70多年的历史。但是需要指出的是，细菌能够对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，其中最为常见的耐药产生机制与两类β-内酰胺酶（分别为亲核性丝氨酸β-内酰胺酶（SBL）和锌依赖性金属-β-内酰胺酶（MBL））（如支持信息中的 S1所示））相关。尽管在临床上联用β-内酰胺和含SBL抑制剂（如克拉维酸）确实可以获得较好的治疗效果；但是随着时间的延长，会有更多不受该等治疗方案影响的SBL和MBL出现。抗菌谱最广的碳青霉烯类抗生素曾被认为是抗感染治疗的“一道防线”，但是随着该类药物的大量使用，很多细菌对其也产生了“地方性”耐药性（能够产生SBL和MBL碳青霉烯酶），这些耐药菌多为革兰氏阴性菌（其中包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）。其中能够产生的具β-内酰胺类抗生素的效用具有抑制作用的β-内酰胺酶包括A类和D类SBL以及B类MBL（例如，IMP-1、VIM-2、SPM-1、NDM-1）。Avibactam（阿维巴坦）是一种广谱SBL抑制剂，并且也是临床上使用的非β-内酰胺β-内酰胺酶抑制剂；然而，但是这种抑制剂对于一些SBL以及大多数MBL均没有有效作用。因此截至目前，人们尚未发现能够同时抑制SBLs和MBL的水解稳定抑制剂。

需要指出的是，在开发能够对上述两类β-内酰胺酶同时具有抑制活性的化合物的过程中，人们常用的一种方法是设计常见四面体中间产物（如图2A上述）或在它之前或之后的过渡态化合物的模拟物。尽管，在发生水解的β-内酰胺类抗生素与MBL之间的“结合”方面，人们已经提出了很多中结构，但是由于当前依旧确保有关MBL与完整底物/密切类似物相互作用的结构研究，因此，该等抑制剂的开发之路存在诸多困难。截至目前，本团队以及其他团队均在探索将β-内酰胺类抗生素的环丁酮类似物作为机械探针（mechanistic probe）以及作为广谱β-内酰胺酶抑制的模板（如图2B所示）方面进行了相关研究。但是需要指出的是，在早期工作中，只有一些化合物表现出了对A类SBL的弱抑制作用。不过，最近本研究发现，青霉烯类化合物的环丁酮类似物对SBL和MBL均表现出了明显的抑制作用。本研究证实，在所测试化合物中，青霉烯类化合物的环丁酮类似物1（如图1所示）是一种对A类和C类SBL最为有效，并对IMP-1MBL具有适度的抑制作用。然而，尽管前期工作已经获得了有关SBL抑制的晶体学证据（其中包括环丁酮通过一个半缩酮 （hemiketal）分子与亲核性丝氨酸结合），但依旧没有获得有关环丁酮如何抑制MBL的信息。

模式调查

São Paulo MBL（SPM‐1）广泛分布于南美、欧洲和北美的革兰氏阴性病原菌铜绿假单胞菌中，与其他B1 MBL（NDM、VIM和IMP）一样，SPM‐1具有双核锌中心，但具有B2 MBL的环状特征，表明它是B1/B2杂合型（如支持信息中的 S2和3所示），因此很难进行抑制。为验证环丁酮可以作为MBL的四面体中间产物类似物的假设，本研究首先针对化合物1与SPM-1结合模式进行了调查。

本研究首先利用19F NMR（如支持信息中的图S4所示）针对化合物1与SPM‐1的结合进行了分析。简而言之，本研究通过利用3-溴-1,1,1-三氟丙酮（BTFA）的半胱氨酸烷基化反应对SPM‐1 α3区的第152位残基进行了选择性标记，这是因为该区域构成了活性位点裂口（active-site cleft）的一部分（如图3A所示）。结果显示，在19F NMR谱图中，经过标记的SPM‐1 （SPM‐1 Y152C*）显示出了两个特征峰，它们分别对应于“α3环”“闭合”构象（ -83.3ppm）和“开放”构象（-72.4ppm）（如图 S5所示）。而加入 已知的MBL抑制剂（例如，异喹啉衍生物、1,10-邻菲咯啉）可以导致α3突变型的19F NMR中谱线加宽和发生化学位移。相比之下，使用化合物1滴定SPM-1 Y152C*并不会对SPM‐1 Y152C* 19F NMR谱图产生显著影响（如图 S5所示）。因此，本研究采用了第二个BtFA标记的突变型“SPM‐1 Y58C*”，在连接α3和α4的L3环上进行19F标记，并且其与活性位点相邻。从图3B可以看出，SPM‐1 Y58C*11a的19F NMR谱图上存在一个主峰（-83.3ppm）。而化合物1（10 μm）的加入导致特征峰发生位移以及锋线加宽，这说明，化合物1以相对于NMR时间尺度的快速交换方式（fast‐exchange manner）在Cys58附近实现结合。通过监测19F化学位移随着化合物1向SPM‐1 Y58C* 中滴定过程中发生的变化，本研究估计KD为22±7 μm。

随后，本研究使用过量抑制剂浸泡晶体，获得了与SPM-1络合的环丁酮1结构。通过分析可以看出，SPM‐1在呈结晶态时，其中的双核锌中心呈“闭合”形式，其中，其α3区域在上述活性位点上发生折叠，并形成以前并未报道的空间群（P4222）。对于未络合晶体，分辨率扩展到1.7Å，对于抑制剂浸泡的晶体，分辨率扩展到2.38Å（详见支持信息中的表 S1）。对于后者而言，其电子密度图显示，化合物1被模拟为其水合形式的活性中心上存在明显的Fo-Fc差异密度（如图4A上述）。与其他B1 MBL一样，SPM-1具有一个双锌离子活性位点，其中一个锌离子结合在（通常为四面体）三组氨酸位点（Zn1），另一个锌离子结合在由保守的天冬氨酸、半胱氨酸和他的残基组成的三角双锥体位点（Zn2）（如图 S3上述）。Wat1“桥接”锌离子，并且被认为为“催化的”亲核试剂。本研究发现，相对于具有相同晶型的未络合 SPM‐1（如表 S1上述），在活性位点中，Zn2发生了一个很小的化学位移 （∼0.5 Å） ，移动后的位置更容易溶剂暴露。但是结果显示，化合物1的结合并不会对金属中心造成显著结构影响，其中在Zn-Wat1；Zn1-Zn2或Zn：蛋白质配体距离方面均不会发生明显变化。需要指出的是，由化合物1引起的显著相互作用发生在Zn2附近。具体而言，化合物1的C4羧酸盐与Zn2（距离为2.48 Å）和Lys219（2.91 Å；如图4C所示）能够直接相互作用，并且这种结合模式可能参与大多数B1 MBL的底物羧酸盐结合（详见在支持信息中的图S7）。相反，本研究发现，化合物1能够与Zn1发生弱相互作用，并且能够与C6酮类化合物的水合物中的两个氧原子发生弱相互作用（Zn1-氧距离分别为3.5Å和4.0Å）。与先前关于环丁酮与MBLS结合模式的预测相反，Zn-桥接（bridging）WAT1确实存在，并且可能与化合物1的两个C6氧原子存在相互作用（2.7Å；如图4C所示）。

对于SPM‐1而言，其与其他B1 MBL相比最明显的差异就是，其含有一个涉及L3环上的Phe57和Tyr58，连接α5和α1的环上的Phe79，“闭合”形式下缠结态α3螺旋上的Phe151和Tyr152以及活性位点裂口对侧上Tyr228的疏水残基的“墙”。SPM‐1与化合物1的结合涉及到其中多个位点的疏水性相互作用，尤其是涉及到Tyr58的芳环之间的双环（与19F-NMR结果一致，如图3B所示）和Tyr228，以及哈哈1与Phe79的边面相互作用（如图4B所示）。Tyr152侧链与化合物1的距离较远，其OH基团6.5Å（晶体链A）或10.8Å（晶体链B）远离化合物1的C7原子，这一结果同样与19F NMR结果相一致（如图 S5所示）。值得注意的是，尽管在不对称单元（晶体学层面）内两个分子的活性中心都明显存在化合物1，但α3环的构象在它们之间存在显著不同（详见支持信息中的图S8）；与结构的其余部分相比，该区域是一个“柔性区域”（B-因子为75 Å2，晶体链A和64Å2，晶体链B），这与关于证明α3柔性的溶液研究所得结果相一致。相反，本研究并没有发现能够支持L3环在与化合物1结合时发生构象变化的证据。本研究发现，当化合物1与Spm-1 Y58C*结合时，19F NMR谱图中存在很大的化学位移变化，这可能是因为58残基更接近抑制剂结合位点，不过，需要指出的是，在晶体学研究中，结果显示α3区域存着更为广泛的构象变化。

实验数据

由于本研究利用酮和水合形式的化合物1进行的完善测试同样得到了类似的统计数据。因此，本研究随后利用NMR就在存在和不存在SPM-1的情况下，化合物1在溶液中的行为进行了分析。为此，本研究合成了C6（酮）位和相邻的C7位二氯化碳原子得到了[13C]标记的化合物1。如C6和C7的13C化学位移（102ppm）和（98.7ppm）C7，JCC=38 Hz所示，在结合研究的条件下，本研究发现，[13C]-1几乎完全以水合物的形式存在，这一结果与以前的工作所得结果相一致。本研究通过13C NMR可以看出，化合物1确实能够与SPM‐1发生结合，其中，水合形式的化合物所对应的特征峰会随着SPM‐1的添加而逐渐减弱（如图3C所示）。需要指出的是，本研究发现，随着在上述化合物1中加入SPM‐1，化合物1的C6或C7峰的化学位移并不会发生变化，并且在190 ppm左右处未出现特征峰，表明C6上存在一个酮基。尽管尚无证据完全排除化合物1以酮形式与SPM-1结合，但是近乎可以确定化合物1以水合形式与SPM-1结合。

在β-内酰胺结合的可能模式下考虑上述结果具有重要意义，这是因为，当前本研究所涉及工作代表了目前可用MBL复合物结构的最接近稳定的完整β-内酰胺类似物。这种结构意味着底物结合过程涉及底物羧酸盐与锌2和邻近的Lys219的相互作用，如水解的β-内酰胺（详见支持信息中的图 S7）和β-内酰胺类似物（如图 S9上述），以及与活性位点周围的疏水基团的相互作用（如图4所示）。该结构支持，该等相互作用参与结合完整的β-内酰胺底物，从而能够在催化早期复合物的形成方面发挥重要作用。

需要注意的是，含有化合物1的配合物的C6氧原子与Zn1之间并不具备强相互作用。人们认为，Zn1位点能够极化β-内酰胺和参与活化的“水解”水（Wat1）。因此，相关研究认为，与完整的β-内酰胺的结合会触发Wat1与Zn2的解离，从而在Zn1上产生了一个“末端”的氢氧化物亲核体。通过Wat1与β-内酰胺羰基反应形成的四面体物种的稳定性可以通过结合Zn1而得到进一步增强，这一点得到了与中间体类似物环硼酸酯络合的MBL的结构分析结果的支持（详见支持信息中的图S9）。并且在水合环丁酮中，C6氧原子可能会发生质子化，这一机制可能会降低C6氧原子与Zn1的亲和力，而有利于与Wat1的相互作用。除此之外，与β-内酰胺衍生的酰胺氮相比，化合物1的非极性C5−H键与Zn2的接近可能需要使Zn1和C6氧原子接近，这可能会存在一定的不利作用。

本研究结果显示，环丁酮对SBL的抑制作用包括通过亲核丝氨酸与酮反应形成半酮键，并将生成的四面体化合物结合在“氧阴离子空穴”之中。与通过SBL实现的稳定四面体中间体不同的是，MBL优先稳定在β-内酰胺羰基上加水/氢氧化物（Wat1）亲核体后形成的开环阴离子中间体，然后再将质子转移到SBL-内酰胺羰基之上（详见支持信息中的图S1）。Zn2与这类物质的阴离子氮的相互作用被认为是中间稳定的重要因素，然而，本结果表明，SPM-1活性中心能够以合理的亲和力结合到一个物种（即水合环丁酮）之上，该物种的四面体碳（C6）原子使其与氧阴离子中间体非常相似。鉴于环丁酮和硼酸盐对所有类别SBL的活性，这些结果表明，作为有效的抑制剂（具有水解稳定性，且对SBL和MBL同时有效）先导化合物，四面体氧阴离子的结构模拟物具有重要价值。