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金属-β-内酰胺酶催化中间体的环丁酮模拟物

浏览数量: 0     作者: 本站编辑     发布时间: 2022-01-30      来源: 本站

金属-β-内酰胺酶催化中间体的环丁酮模拟物

金属-β-内酰胺酶催化中间体的环丁酮模拟物

摘要:

相关研究已经证实,细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的机制主要涉及两类β-内酰胺酶(分别为亲核性丝氨酸(SBL)和金属-β-内酰胺酶(MBL))对药物的水解过程。环丁酮是一种水解稳定型β-内酰胺类似物,该等类似物对SBL和MBL均具有潜在抑制作用。本项工作主要针对环丁酮青霉烯类似物与临床上重要的MBL SPM-1之间的相互作用进行了溶液和结晶学层面的研究。通过使用19F标记的SPM-1进行NMR测试可以看出,环丁酮与SPM-1之间存在微摩尔水平的亲和力。从SPM-1:环丁酮复合物的晶体结构可以看出,水合环丁酮能够通过与其中一个锌离子相互作用而“成键”,并且该该水合物能够通过与“锌结合水”形成氢键获得稳定,以及疏水基团与芳香族残基之间存在接触。除此之外,从上述信息中还可以看出,未来有必要进行有关使用过渡态和(或)中间体类似物作为所有类型的β-内酰胺酶抑制剂的研究。

耐药性

作为目前一类最为常见的抗生素,β-内酰胺类药物(如图1所示)的应用已有70多年的历史。但是需要指出的是,细菌能够对β-内酰胺类抗生素产生耐药性,其中最为常见的耐药产生机制与两类β-内酰胺酶(分别为亲核性丝氨酸β-内酰胺酶(SBL)和锌依赖性金属-β-内酰胺酶(MBL))(如支持信息中的 S1所示))相关。尽管在临床上联用β-内酰胺和含SBL抑制剂(如克拉维酸)确实可以获得较好的治疗效果;但是随着时间的延长,会有更多不受该等治疗方案影响的SBL和MBL出现。抗菌谱最广的碳青霉烯类抗生素曾被认为是抗感染治疗的“一道防线”,但是随着该类药物的大量使用,很多细菌对其也产生了“地方性”耐药性(能够产生SBL和MBL碳青霉烯酶),这些耐药菌多为革兰氏阴性菌(其中包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌)。其中能够产生的具β-内酰胺类抗生素的效用具有抑制作用的β-内酰胺酶包括A类和D类SBL以及B类MBL(例如,IMP-1、VIM-2、SPM-1、NDM-1)。Avibactam(阿维巴坦)是一种广谱SBL抑制剂,并且也是临床上使用的非β-内酰胺β-内酰胺酶抑制剂;然而,但是这种抑制剂对于一些SBL以及大多数MBL均没有有效作用。因此截至目前,人们尚未发现能够同时抑制SBLs和MBL的水解稳定抑制剂。

需要指出的是,在开发能够对上述两类β-内酰胺酶同时具有抑制活性的化合物的过程中,人们常用的一种方法是设计常见四面体中间产物(如图2A上述)或在它之前或之后的过渡态化合物的模拟物。尽管,在发生水解的β-内酰胺类抗生素与MBL之间的“结合”方面,人们已经提出了很多中结构,但是由于当前依旧确保有关MBL与完整底物/密切类似物相互作用的结构研究,因此,该等抑制剂的开发之路存在诸多困难。截至目前,本团队以及其他团队均在探索将β-内酰胺类抗生素的环丁酮类似物作为机械探针(mechanistic probe)以及作为广谱β-内酰胺酶抑制的模板(如图2B所示)方面进行了相关研究。但是需要指出的是,在早期工作中,只有一些化合物表现出了对A类SBL的弱抑制作用。不过,最近本研究发现,青霉烯类化合物的环丁酮类似物对SBL和MBL均表现出了明显的抑制作用。本研究证实,在所测试化合物中,青霉烯类化合物的环丁酮类似物1(如图1所示)是一种对A类和C类SBL最为有效,并对IMP-1MBL具有适度的抑制作用。然而,尽管前期工作已经获得了有关SBL抑制的晶体学证据(其中包括环丁酮通过一个半缩酮 (hemiketal)分子与亲核性丝氨酸结合),但依旧没有获得有关环丁酮如何抑制MBL的信息。

模式调查

São Paulo MBL(SPM‐1)广泛分布于南美、欧洲和北美的革兰氏阴性病原菌铜绿假单胞菌中,与其他B1 MBL(NDM、VIM和IMP)一样,SPM‐1具有双核锌中心,但具有B2 MBL的环状特征,表明它是B1/B2杂合型(如支持信息中的 S2和3所示),因此很难进行抑制。为验证环丁酮可以作为MBL的四面体中间产物类似物的假设,本研究首先针对化合物1与SPM-1结合模式进行了调查。

本研究首先利用19F NMR(如支持信息中的图S4所示)针对化合物1与SPM‐1的结合进行了分析。简而言之,本研究通过利用3-溴-1,1,1-三氟丙酮(BTFA)的半胱氨酸烷基化反应对SPM‐1 α3区的第152位残基进行了选择性标记,这是因为该区域构成了活性位点裂口(active-site cleft)的一部分(如图3A所示)。结果显示,在19F NMR谱图中,经过标记的SPM‐1 (SPM‐1 Y152C*)显示出了两个特征峰,它们分别对应于“α3环”“闭合”构象( -83.3ppm)和“开放”构象(-72.4ppm)(如图 S5所示)。而加入 已知的MBL抑制剂(例如,异喹啉衍生物、1,10-邻菲咯啉)可以导致α3突变型的19F NMR中谱线加宽和发生化学位移。相比之下,使用化合物1滴定SPM-1 Y152C*并不会对SPM‐1 Y152C* 19F NMR谱图产生显著影响(如图 S5所示)。因此,本研究采用了第二个BtFA标记的突变型“SPM‐1 Y58C*”,在连接α3和α4的L3环上进行19F标记,并且其与活性位点相邻。从图3B可以看出,SPM‐1 Y58C*11a的19F NMR谱图上存在一个主峰(-83.3ppm)。而化合物1(10 μm)的加入导致特征峰发生位移以及锋线加宽,这说明,化合物1以相对于NMR时间尺度的快速交换方式(fast‐exchange manner)在Cys58附近实现结合。通过监测19F化学位移随着化合物1向SPM‐1 Y58C* 中滴定过程中发生的变化,本研究估计KD为22±7 μm。

随后,本研究使用过量抑制剂浸泡晶体,获得了与SPM-1络合的环丁酮1结构。通过分析可以看出,SPM‐1在呈结晶态时,其中的双核锌中心呈“闭合”形式,其中,其α3区域在上述活性位点上发生折叠,并形成以前并未报道的空间群(P4222)。对于未络合晶体,分辨率扩展到1.7Å,对于抑制剂浸泡的晶体,分辨率扩展到2.38Å(详见支持信息中的表 S1)。对于后者而言,其电子密度图显示,化合物1被模拟为其水合形式的活性中心上存在明显的Fo-Fc差异密度(如图4A上述)。与其他B1 MBL一样,SPM-1具有一个双锌离子活性位点,其中一个锌离子结合在(通常为四面体)三组氨酸位点(Zn1),另一个锌离子结合在由保守的天冬氨酸、半胱氨酸和他的残基组成的三角双锥体位点(Zn2)(如图 S3上述)。Wat1“桥接”锌离子,并且被认为为“催化的”亲核试剂。本研究发现,相对于具有相同晶型的未络合 SPM‐1(如表 S1上述),在活性位点中,Zn2发生了一个很小的化学位移 (∼0.5 Å) ,移动后的位置更容易溶剂暴露。但是结果显示,化合物1的结合并不会对金属中心造成显著结构影响,其中在Zn-Wat1;Zn1-Zn2或Zn:蛋白质配体距离方面均不会发生明显变化。需要指出的是,由化合物1引起的显著相互作用发生在Zn2附近。具体而言,化合物1的C4羧酸盐与Zn2(距离为2.48 Å)和Lys219(2.91 Å;如图4C所示)能够直接相互作用,并且这种结合模式可能参与大多数B1 MBL的底物羧酸盐结合(详见在支持信息中的图S7)。相反,本研究发现,化合物1能够与Zn1发生弱相互作用,并且能够与C6酮类化合物的水合物中的两个氧原子发生弱相互作用(Zn1-氧距离分别为3.5Å和4.0Å)。与先前关于环丁酮与MBLS结合模式的预测相反,Zn-桥接(bridging)WAT1确实存在,并且可能与化合物1的两个C6氧原子存在相互作用(2.7Å;如图4C所示)。

对于SPM‐1而言,其与其他B1 MBL相比最明显的差异就是,其含有一个涉及L3环上的Phe57和Tyr58,连接α5和α1的环上的Phe79,“闭合”形式下缠结态α3螺旋上的Phe151和Tyr152以及活性位点裂口对侧上Tyr228的疏水残基的“墙”。SPM‐1与化合物1的结合涉及到其中多个位点的疏水性相互作用,尤其是涉及到Tyr58的芳环之间的双环(与19F-NMR结果一致,如图3B所示)和Tyr228,以及哈哈1与Phe79的边面相互作用(如图4B所示)。Tyr152侧链与化合物1的距离较远,其OH基团6.5Å(晶体链A)或10.8Å(晶体链B)远离化合物1的C7原子,这一结果同样与19F NMR结果相一致(如图 S5所示)。值得注意的是,尽管在不对称单元(晶体学层面)内两个分子的活性中心都明显存在化合物1,但α3环的构象在它们之间存在显著不同(详见支持信息中的图S8);与结构的其余部分相比,该区域是一个“柔性区域”(B-因子为75 Å2,晶体链A和64Å2,晶体链B),这与关于证明α3柔性的溶液研究所得结果相一致。相反,本研究并没有发现能够支持L3环在与化合物1结合时发生构象变化的证据。本研究发现,当化合物1与Spm-1 Y58C*结合时,19F NMR谱图中存在很大的化学位移变化,这可能是因为58残基更接近抑制剂结合位点,不过,需要指出的是,在晶体学研究中,结果显示α3区域存着更为广泛的构象变化。

实验数据

由于本研究利用酮和水合形式的化合物1进行的完善测试同样得到了类似的统计数据。因此,本研究随后利用NMR就在存在和不存在SPM-1的情况下,化合物1在溶液中的行为进行了分析。为此,本研究合成了C6(酮)位和相邻的C7位二氯化碳原子得到了[13C]标记的化合物1。如C6和C7的13C化学位移(102ppm)和(98.7ppm)C7,JCC=38 Hz所示,在结合研究的条件下,本研究发现,[13C]-1几乎完全以水合物的形式存在,这一结果与以前的工作所得结果相一致。本研究通过13C NMR可以看出,化合物1确实能够与SPM‐1发生结合,其中,水合形式的化合物所对应的特征峰会随着SPM‐1的添加而逐渐减弱(如图3C所示)。需要指出的是,本研究发现,随着在上述化合物1中加入SPM‐1,化合物1的C6或C7峰的化学位移并不会发生变化,并且在190 ppm左右处未出现特征峰,表明C6上存在一个酮基。尽管尚无证据完全排除化合物1以酮形式与SPM-1结合,但是近乎可以确定化合物1以水合形式与SPM-1结合。

在β-内酰胺结合的可能模式下考虑上述结果具有重要意义,这是因为,当前本研究所涉及工作代表了目前可用MBL复合物结构的最接近稳定的完整β-内酰胺类似物。这种结构意味着底物结合过程涉及底物羧酸盐与锌2和邻近的Lys219的相互作用,如水解的β-内酰胺(详见支持信息中的图 S7)和β-内酰胺类似物(如图 S9上述),以及与活性位点周围的疏水基团的相互作用(如图4所示)。该结构支持,该等相互作用参与结合完整的β-内酰胺底物,从而能够在催化早期复合物的形成方面发挥重要作用。

需要注意的是,含有化合物1的配合物的C6氧原子与Zn1之间并不具备强相互作用。人们认为,Zn1位点能够极化β-内酰胺和参与活化的“水解”水(Wat1)。因此,相关研究认为,与完整的β-内酰胺的结合会触发Wat1与Zn2的解离,从而在Zn1上产生了一个“末端”的氢氧化物亲核体。通过Wat1与β-内酰胺羰基反应形成的四面体物种的稳定性可以通过结合Zn1而得到进一步增强,这一点得到了与中间体类似物环硼酸酯络合的MBL的结构分析结果的支持(详见支持信息中的图S9)。并且在水合环丁酮中,C6氧原子可能会发生质子化,这一机制可能会降低C6氧原子与Zn1的亲和力,而有利于与Wat1的相互作用。除此之外,与β-内酰胺衍生的酰胺氮相比,化合物1的非极性C5−H键与Zn2的接近可能需要使Zn1和C6氧原子接近,这可能会存在一定的不利作用。

本研究结果显示,环丁酮对SBL的抑制作用包括通过亲核丝氨酸与酮反应形成半酮键,并将生成的四面体化合物结合在“氧阴离子空穴”之中。与通过SBL实现的稳定四面体中间体不同的是,MBL优先稳定在β-内酰胺羰基上加水/氢氧化物(Wat1)亲核体后形成的开环阴离子中间体,然后再将质子转移到SBL-内酰胺羰基之上(详见支持信息中的图S1)。Zn2与这类物质的阴离子氮的相互作用被认为是中间稳定的重要因素,然而,本结果表明,SPM-1活性中心能够以合理的亲和力结合到一个物种(即水合环丁酮)之上,该物种的四面体碳(C6)原子使其与氧阴离子中间体非常相似。鉴于环丁酮和硼酸盐对所有类别SBL的活性,这些结果表明,作为有效的抑制剂(具有水解稳定性,且对SBL和MBL同时有效)先导化合物,四面体氧阴离子的结构模拟物具有重要价值。


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